Биостимуляция культивируемых фибробластов человека с помощью диодного лазера 980 нм
Справочная информация: фибробласты - основные
клетки, участвующие в регенерации во время заживления ран. Цель состояла в том,
чтобы определить влияние диодного лазера с длиной волны 980 нм на
культивируемые фибробласты человека с использованием различных режимов
облучения.
Методы: линия клеток эпителиальных фибробластов человека CCD-1064Sk
обрабатывалась диодным лазером с длиной волны 980 нм при различных дозах
энергии (мощность: 0, 2–1 Вт и плотность энергии: 1–7 Дж / см2) с
использованием различных режимов передачи (непрерывного или импульсного).
Влияние на рост клеток через 24 и 72 часа после обработки исследовали путем
измерения пролиферативной способности, влияния на клеточный цикл и влияния на
дифференцировку клеток.
Результаты: пролиферативная способность фибробластов увеличивалась через 24 и 72
часа после обработки в зависимости от дозы энергии. Наибольшее увеличение
наблюдалось при мощности 0, 2 или 0, 5 Вт и плотности энергии от 1 до 4 Дж /
см2; разницы между непрерывным и импульсным режимами не наблюдалось. Не было
значительных различий в клеточном цикле между обработанными группами и
контрольными группами. Экспрессия α-актина увеличивалась под действием
обработки, что указывает на усиление дифференцировки клеток.
Заключение: диодный лазер 980 нм оказывает биостимулирующее действие на
фибробласты, стимулируя пролиферативную способность и дифференцировку клеток
без изменения клеточного цикла. Необходимы дальнейшие исследования для изучения
его потенциальной клинической применимости при заживлении ран.
Введение
Лазеры широко используются для хирургических /
термических (высокоинтенсивная лазерная терапия, HILT) или других
терапевтических (низкоуровневая лазерная терапия, LLLT) целей. Терапевтическая
ценность НИЛИ заключается в трофических, противовоспалительных и обезболивающих
эффектах, которые возникают в результате преобразования световой энергии в
биохимическую. Из-за своих биостимулирующих свойств используются различные типы
низкоуровневых лазеров, включая твердотельные лазеры, такие как Nd: YAG,
газовые лазеры, такие как гелий-неоновый (HeNe) или CO2, жидкие лазеры, диодные
полупроводниковые лазеры, наиболее распространенными из которых являются
арсенид галлия (GaAs), алюминий, арсенид галлия индия (InGaAs) и фосфид
арсенида галлия индия (InGaAsP). Эти лазеры работают в различных режимах:
непрерывные волны (CW) или импульсные (CP), и они очень эффективны при
применении в мягких тканях с отличным эффектом при заживлении ран. Различные
исследования продемонстрировали, что низкоуровневое лазерное облучение (LLLI)
может увеличивать пролиферацию, дифференциацию и миграцию клеток в тканях за
счет стимуляции фактора роста и синтеза цитокинов, тем самым повышая их
регенеративную способность. Терапевтический потенциал воздействия LLLI на
фибробласты был предложен, но отсутствуют убедительные подтверждающие данные
или консенсус относительно наиболее подходящего протокола лечения, который
должен учитывать длину волны лазерного излучения, мощность и плотность энергии,
и даже возможность сочетание красного спектра и инфракрасных длин волн.
Фибробласты являются важным клеточным
компонентом мягких тканей и основными клетками, участвующими в заживлении ран,
способствуя восстановлению физиологии тканей, обеспечивая факторы роста и белки
внеклеточного матрикса. Поражения мягких тканей представляют собой важную
проблему здравоохранения, особенно хронические поражения, учитывая их
распространенность, связанные с этим расходы на здравоохранение и их влияние на
качество жизни пациентов. Поэтому поиск новых подходов к регенерации
поврежденной ткани представляет большой клинический интерес.
Известно, что рост и дифференцировка
остеобластов, ответственных за формирование и регенерацию костей, усиливается
обработкой диодным лазером 948 нм, и этот эффект приписывают высвобождению
аутокринных факторов (например, TGFβ1 или BMP-2) остеобластами в ответ на
облучение. Однако нет данных о влиянии этого лечения на другие популяции
клеток, такие как фибробласты.
Помимо его потенциальной терапевтической
ценности и неинвазивного применения, еще одним преимуществом диодного лазера с длиной волны 980 нм является
его небольшой размер и простота в обращении. Следовательно, его полезность в
повседневном клиническом вмешательстве жизнеспособна.
Таким образом, целью данного исследования было
определить влияние различных клеточных параметров (рост, клеточный цикл и
экспрессия поверхностных маркеров) на культивируемые человеческие фибробласты,
обработанные этим лазером с использованием различных режимов облучения, сочетая
различные значения мощности, плотности энергии и режимы облучения (непрерывное
и импульсное).
Полученные результаты
Влияние
диодного лазера 980 нм на рост фибробластов
В ходе первоначального скринингового
исследования был определен оптимальный режим облучения для биостимуляции
фибробластов диодным лазером с длиной волны 980 нм. Пролиферативный эффект на
линию клеток эпителиальных фибробластов человека CCD-1064SK оценивали через 24
часа после обработки в режиме CW с различными комбинациями значений мощности
(0, 2, 0, 5 или 1 Вт) и значений плотности энергии (1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 Дж /
см2). Полученные результаты показывают
статистически значимое увеличение пролиферации клеток, обработанных мощностью
0, 2 Вт при различных плотностях энергии, по сравнению с необработанными
клетками (контрольная группа); это увеличение было дозозависимым, за
исключением самой высокой изученной плотности энергии (7 Дж / см2). Когда
мощность составляла 0, 5 Вт, пролиферативная способность значительно увеличивалась
при плотностях 1, 2, 3 и 4 Дж / см2, но снижалась при плотностях выше 4 Дж /
см2 до тех пор, пока не достигла значений, аналогичных контрольным. Обработка
мощностью 1 Вт снижала скорость роста при всех исследованных плотностях
энергии.
На основании вышеизложенных данных,
пролиферативная способность была определена через 72 часа после обработки при
значениях мощности 0, 2 или 0, 5 Вт и плотностях энергии 1, 2, 3, 4, 5 или 6 Дж
/ см2, которые применялись непрерывно. волновой (CW) или импульсный режим с
рабочим циклом 20% (CP0) или 50% (CP3). Результаты, полученные через 72 часа
после применения различных обработок, демонстрирующие значительное (p < 0,
003) увеличение роста по сравнению с контролем в клетках, обработанных
мощностью 0, 2 Вт, независимо от режима передачи (CW, CP0 или CP3)., за
исключением плотностей энергии 5 или 6 Дж / см2, когда не было значительного
изменения скорости роста.
Влияние
диодного лазера 980 нм на клеточный цикл фибробластов
Не было обнаружено значительных изменений процентного
содержания клеток в каждой фазе клеточного цикла между обработанными и
необработанными клетками. Во всех случаях, независимо от приложенной энергии,
клеточный цикл был нормальным и не наблюдалось анеуплоидии ДНК или признаков
злокачественной трансформации.
Влияние
диодного лазера 980 нм на экспрессию фибронектина и α-актина в фибробластах
Иммунофлуоресценцию использовали для
определения эффекта лазерной обработки на экспрессию α-актина и фибронектина
через 72 часа. Экспрессия α-актина и фибронектина была интенсивной в клетках,
обработанных в режиме CW с мощностью 0, 2 или 0, 5 Вт и плотностью энергии 3
или 4 Дж / см2. Фибронектин, но не α-актин, экспрессировался необработанными
клетками. Аналогичным образом мы можем наблюдать, что обработка вызывает
морфологические изменения, типичные для дифференцированных клеток, в виде более
округлой морфологии.
Обсуждение результатов
Биостимулирующие эффекты LLLI на клеточные
популяции зависят от типа лазера, длины волны излучения, дозы энергии и режима
передачи, поэтому необходимо установить оптимальные параметры лечения для
различных лазеров. Настоящее исследование демонстрирует, что рост фибробластов
можно стимулировать с помощью диодного лазера с длиной волны 980 нм при
определенных условиях лечения (режим, мощность и плотность энергии).
Преимущества этого типа лазера заключаются в его небольшом размере и простоте
использования.
Таким образом, пролиферативная способность
фибробластов стимулировалась обработкой в режиме CW мощностью 0, 2 или 0, 5
Вт, хотя этот эффект зависел от приложенной плотности энергии. Однако
биостимулирующий эффект на рост клеток не наблюдался после обработки мощностью
1 Вт. Следовательно, существует порог мощности, выше которого биостимулирующий
эффект облучения исчезает, как также сообщалось Huertas et al. в своем
исследовании воздействия того же лазера на рост клеток остеобластов MG63 через
24 часа. Таким образом, можно предположить, что облучение диодным лазером 980
нм оказывает биостимулирующее действие на эпителиальные фибробласты человека
при мощности лазера 0, 2 или 0, 5 Вт.
Через 72 часа обработки рост клеток был ниже при
более высоких дозах энергии при обоих режимах передачи, что может быть связано
с дифференцировкой фибробластов. Это объяснение подтверждается повышенной
клеточной экспрессией α-актина, классического маркера дифференцировки
фибробластов в миофибробласты, которые являются ключевыми клетками в заживлении
тканей. В связи с этим, богатая тромбоцитами плазма (PRP) использовалась в
регенеративном лечении и была предложена как полезный вариант для заживления
ран, особенно в хронических случаях.
PRP действует, поставляя факторы роста,
особенно TGF-β1, основной фактор роста, индуцирующий дифференцировку
фибробластов в миофибробласты. Исследования in vitro сообщили о более быстром
росте фибробластов после первичного культивирования в присутствии PRP в
качестве единственного источника фактора роста, чем после культивирования в
присутствии FBS. Однако после определенного периода времени культивирования с
PRP рост клеток останавливается и даже обращается вспять по сравнению с теми же
клетками, культивируемыми с FBS. Эта пониженная скорость роста связана с
другими изменениями морфологической ультраструктуры и экспрессии маркеров
клеток, включая увеличение экспрессии α-актина. Эти клеточные изменения
указывают на дифференцировку фибробластов в миофибробласты. Эти данные, вместе
с настоящими открытиями, предполагают, что действие лазера на фибробласты может
быть аналогично действию PRP, стимулируя рост клеток и индуцируя
дифференцировку фибробластов в миофибробласты выше определенной дозы или по
истечении заданного периода времени, соответственно. С другой стороны, Ren et
al. предположили, что диодный низкоуровневый лазер показал положительное
влияние на ускорение пролиферации фибробластов за счет изменений в экспрессии
генов и высвобождения факторов роста. Кроме того, Hakki & Bozkurt
продемонстрировали, что нехирургическое применение лазера модулирует поведение
фибробластов десен, вызывая экспрессию мРНК факторов роста, и эти приложения
можно использовать для улучшения заживления ран пародонта.
Предыдущие исследования показали, что рост
остеобластоподобных клеток MG63 (MG63) индуцировался обработкой тем же лазером.
Этот эффект, по-видимому, связан с повышенной экспрессией гена TGF-β1 и его
рецепторов в результате лазерного лечения.
В недавнем исследовании in vitro лечение фибробластов
десны лазером с длиной волны 780 нм нейтрализовало побочные эффекты
провоспалительных цитокинов, особенно интерлейкина 6 (IL-6), интерлейкина 8
(IL-8) и фактора некроза опухоли α (TNFα), на эту популяцию клеток в
хронических ранах, например, подавление роста, миграции или экспрессии фактора
роста, тем самым способствуя регенерации ткани. Авторы пришли к выводу, что
LLLI может стимулировать функцию клеток в ранах слизистой оболочки полости рта
даже в присутствии высоких уровней медиаторов воспаления. В рамках ограничений
исследований in vitro как их выводы, так и настоящие результаты подтверждают
необходимость дальнейших исследований для изучения клинического потенциала LLLI
в регенерации тканей.
Результаты исследования клеточного цикла не
показали значительных различий между клетками, обработанными лазером, и
контрольными клетками на стадии G0 / G1, G2 / M или S. Профиль клеточного цикла
был нормальным во всех случаях, и отсутствие анеуплоидных клеток ДНК или
признаков неопластических трансформаций не обнаружено. Это очень важное
открытие, учитывая возможную потерю контроля над ростом и малигнизацию клеток,
которая может возникнуть в результате облучения.
В заключение, наши данные показывают, что
лечение диодным лазером 980 нм в непрерывном или импульсном режиме передачи
энергии стимулирует рост фибробластов и вызывает дифференцировку простым и
недорогим способом, если мощность лазера не превышает 0,5 Вт и плотность
энергии поддерживается от 1 до 4 Дж / см2. Дальнейшие исследования необходимы
для определения терапевтического протокола, как это предлагают другие авторы, и
для выяснения механизмов, лежащих в основе биостимулирующего действия излучения
диодного лазера с длиной волны 980 нм на фибробласты, а также для изучения
возможных клинических применений.
Методы
Культура
клеток
Клеточная линия эпителиальных фибробластов
человека CCD-1064Sk была приобретена из Американской коллекции типовых культур
и сохранена в среде Игла, модифицированной Дульбекко с 100 МЕ / мл пенициллина,
2,5 мкг / мл амфотерицина B, 1% глутамина и 2% HEPES с добавлением 10%
фетальной телячьей сыворотки (FBS). Культуры хранили при 37 ° C в увлажненной
атмосфере, состоящей из 95% воздуха и 5% CO2. Клетки отделяли от колбы для
культивирования раствором 0,05% трипсина и 0,02% этилендиаминтетрауксусной
кислоты (EDTA), а затем промывали и суспендировали в полной культуральной среде
с 10% FBS.
Лазерное
облучение
В этом исследовании использовался диодный
лазер, который работает в ближнем инфракрасном спектре на длине волны 980 нм с максимальной
выходной мощностью 10 Вт и диаметром пятна 400 микрон. Это устройство имеет
наконечник для биостимуляции, который позволяет настроить луч света таким
образом, чтобы он касался облучаемой поверхности. Этот образец использовался во
всех проведенных тестах.
Клетки высевали в 24-луночные планшеты на
адекватном расстоянии между лунками, чтобы избежать перекрытия или рассеянного
излучения. Через 24 ч культуры облучали импульсами при различных значениях
мощности (0,2, 0,5 или 1 Вт) и плотности энергии (1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 Дж /
см2), удерживая наконечник зонда на расстоянии 1 см от клеточного слоя. В
каждом случае использовались три различных режима лечения: непрерывный (CW) или
импульсный режим с рабочим циклом 20% (CP0) или 50% (CP3). Время облучения
определяется плотностью энергии и приложенной мощностью (в режиме CW для
плотности энергии «a» требуется «x» секунд; в режиме CP0 для той же плотности
энергии требуется «4x» секунды; а для режима CP3 требуется «2x» секунды). Во
всех анализах планшет был открыт во время облучения, которое проводилось при
комнатной температуре. Контрольные клетки подвергались идентичной процедуре с
выключенным лазером.
Анализ
пролиферации клеток
После лазерной обработки в вышеуказанных
условиях исследования клетки инкубировали в течение 24 или 72 часов и измеряли
пролиферацию клеток с помощью анализа МТТ. Вкратце, среду заменяли на DMEM без
фенолового красного, содержащую 0,5 мг / мл МТT, и инкубировали в течение 4
часов. Клеточное восстановление тетразолиевого кольца МТТ привело к образованию
темно-пурпурного нерастворимого в воде осадка кристаллов формазана. После
инкубации среду отсасывали и добавляли диметилсульфоксид (ДМСО) для растворения
кристаллов формазана. Затем измеряли оптическую плотность при 570 нм с помощью
спектрофотометра. Результаты выражали как% распространения по отношению к
контрольной группе, используя следующую формулу:
% пролиферации = (OD570 обработанной группы /
OD570 контрольной группы) × 100.
Для каждого лечения проводилось не менее трех
экспериментов с использованием среднего значения в анализах.
Анализ
клеточного цикла
Исследование клеточного цикла линии фибробластов
CCD-1064Sk проводили методом проточной цитометрии в соответствии с процедурой,
описанной Manzano-Moreno et al. Перед обработкой мы проводили голодание клеток
для синхронизации, для чего клетки выращивали на среде DMEM без FBS. Вкратце,
фибробласты обрабатывали диодным лазером 980 нм в непрерывном режиме при
различных условиях (мощность 0,2 или 0,5 Вт и плотность энергии 2, 3 или 4 Дж /
см2) в течение 24 ч при 37 ° C. Затем клетки отделяли от колбы для
культивирования раствором 0,05% трипсина и 0,02% (мас. / Об.), промывали и
суспендировали в физиологическом растворе с фосфатным буфером (PBS) при
концентрации 2 × 104 клеток / мл; 2 мл ледяного 70% этанола и 30%
дистиллированной H2O энергично добавляли к 200 мкл клеточной суспензии. Клетки
оставляли во льду не менее чем на 30 мин. В конце этого периода клетки собирали
центрифугированием и ресуспендировали в 800 мкл PBS. Клетки исследовали под
микроскопом и, когда они образовались, пропускали через иглу шприца 25-го
размера. Затем клетки инкубировали при 37 ° C в течение 30 минут со 100 мкл
РНКазы (1 мг / мл) и 100 мкл йодида пропидия (PI). Наконец, образцы были
проанализированы с использованием аргон-ионного лазера, настроенного на 488 нм,
измерения прямого и ортогонального светорассеяния и красной флуоресценции, а
также определение площади и пика флуоресцентного сигнала, когда возможный.
Результаты выражали как процент клеток в каждой фазе (G0 / G1, S и G2 / M).
Иммунофлуоресценция
Фибробласты обрабатывали диодным лазером 980
нм в непрерывном режиме в различных условиях (мощность 0,2 или 0,5 Вт и
плотность энергии 3 или 4 Дж / см2) в течение 72 ч при 37 ° C.
Иммуноокрашивание проводили на клетках, фиксированных ледяной смесью
метанол-ацетон (1: 1) в течение 10 мин, а затем промывали PBS. Затем клетки блокировали
FBS (10% в PBS) в течение 30 минут и инкубировали в течение 2 часов с
исследуемыми mAb (фибронектин и α-актин) при разведении 1: 500. Контрастное
окрашивание ядер 4,6-диамидино-2-фенилиндолом проводили после удаления
избыточных антител. Иммуноокрашивание визуализировали с помощью конфокального
лазерного микроскопа Leica Spectral.
