Иммуномодулирующие эффекты Nd: YAG (1064 нм) и диодного лазера (810 нм) с длинами волн LPS-стимулированных фибробластов десен человека

Фибробласты десен человека (hGF) участвуют в воспалительных реакциях на бактерии, распознавая молекулярные паттерны, связанные с патогенами. В поисках стратегий модуляции хозяина для повышения толерантности к ЛПС в качестве альтернативного лечения, уменьшающего воспаление тканей пародонта, была предложена низкоуровневая лазерная терапия (НИЛ). В этом исследовании мы исследуем, модулируют ли длины волны лазера 810 нм (диод) и 1064 нм (Nd: YAG) провоспалительные реакции на LPS проблемы в hGF.

Первичные hGF заражали LPS Porphyromonas gingivalis и облучали либо диодным (810 нм), либо Nd: YAG (1064 нм) лазерами. Культуры клеток исследовали на пролиферацию с помощью МТТ-анализа и экспрессию IL-6 и IL-8 с помощью кПЦР через 24, 48 и 72 часа. Уровни белков IL-6 и IL-8 определяли с помощью ELISA.

Наивные популяции hGF, облученные как диодными лазерами 810 нм, так и Nd: YAG 1064 нм, продемонстрировали клеточную пролиферацию (p < 0, 05), но LLLT не повлияла на жизнеспособность клеток в LPS-стимулированных клетках. Уровни экспрессии генов IL-6 и IL-8 выявили значительные противовоспалительные эффекты облучения с обеими исследуемыми длинами волн на hGF, зараженные LPS P.gingivalis. Уровни белка этих цитокинов увеличивались при провокации LPS. Лечение НИЛИ ингибировало это увеличение для обеих длин волн, оцениваемых в исследовании, на статистически значимом уровне, особенно в течение первых 48 часов.

Настоящее исследование демонстрирует модулирующий эффект LLLT с использованием как диода 810 нм, так и лазеров Nd: YAG 1064 нм в фибробластах десен за счет снижения продукции IL-6, IL-8 в ответ на LPS.

Введение

Пародонтит - воспалительное заболевание опорной конструкции зубов, то есть пародонта. Клинически пародонтит проявляется потерей прикрепления пародонта в ответ на хронические инфекции, вызванные различными пародонтопатическими бактериями. Пародонтологические бактерии являются условно-патогенными микроорганизмами, и их присутствие не всегда приводит к клиническим воспалительным заболеваниям. Предпосылкой деструктивного воспаления является мощный провоспалительный ответ хозяина, который нарушает гомеостатическое равновесие между вездесущими бактериями полости рта и защитными барьерами мягких тканей пародонта в десневой щели. Porphyromonas gingivalis - важные пародонтопатические бактерии, которые участвуют в развитии и прогрессировании пародонтита. Воспаление, вызванное инфекцией P. gingivalis, приводит к разрушению тканей пародонта, резорбции костной ткани и, в конечном итоге, к потере зубов. Среди многих вирулентных факторов P. gingivalis его липополисахарид (LPS), компонент клеточной стенки грамотрицательных бактерий, действует как мощный стимулятор иммунного ответа хозяина через распознавание Toll-подобных рецепторов (TLR) 2 и 4. Прогресс пародонтита зависит от иммунного ответа хозяина на инвазию P.gingivalis иммунными и тканевыми контролирующими клетками.

В барьере мягких тканей пародонта численно неиммунные клетки, несущие TLR, такие как фибробласты десен человека (hGF), участвуют в воспалительных реакциях на бактерии. В частности, hGF распознают связанные с патогенами молекулярные структуры и в ответ вырабатывают воспалительные цитокины, включая интерлейкин-6 (IL-6) и интерлейкин-8 (IL-8).

Опубликованные исследования показали, что hGFs экспрессируют рецепторы как TLR4, так и CD14, что подтверждает их способность функционально реагировать на LPS. Толерантность к липополисахаридам - ​​это механизм, предотвращающий чрезмерный и продолжительный иммунный ответ хозяина на ЛПС. Многие факторы участвуют в толерантности к LPS, например, подавление экспрессии TLR4, индукция подавления передачи сигналов цитокина-1 (SOCS-1). Профессиональные иммунные клетки, участвующие в воспалительных реакциях при пародонтите, такие как макрофаги, лимфоциты и нейтрофилы, развивают толерантность к ЛПС, таким образом, они обладают механизмом регулирования хронического присутствия пародонтальных бактерий в ротовой полости. Тем не менее, Ara et al. предположили, что продукция цитокинов фибробластами десен может быть важна для поддержания воспаления даже после длительного воздействия ЛПС. Их исследование с использованием LPS из P. gingivalis и Escherichia coli пришло к выводу, что фибробласты десен вряд ли разовьют толерантность к LPS. Таким образом, роль ответов фибробластов десен на LPS является критической для гомеостатического баланса пародонта.

В поисках стратегий модуляции хозяина для повышения толерантности к ЛПС в качестве альтернативного лечения, которое уменьшает воспаление пародонта, была предложена низкоуровневая лазерная терапия (НИЛ). НИЛИ уменьшает боль и воспаление, но также ускоряет заживление.

НИЛИ усиливает пролиферацию клеток и контролирует воспалительную реакцию, активируя дыхательную цепь митохондрий, в основном через цитохром с оксидазу, активируя последовательность сигнальных путей. Хотя нет единого мнения о наиболее подходящем протоколе, из предыдущих исследований явствует, что биостимулирующий эффект диодных лазеров наблюдается в красном и ближнем инфракрасном диапазонах (660-940 нм), поскольку эти длины волн демонстрируют меньшее поглощение воды и хромофора в тканях, что приводит к лучшему проникновению в ткани. Несколько исследований показывают, что использование диодного лазера (635 нм) снижает количество активных форм кислорода (АФК) и снижает окислительный стресс. Уменьшение количества активных форм кислорода, которые опосредуют фосфолипазу, привело к приостановке продукции COX-2 и PGE-2. Также известно, что излучение с длиной волны 635 нм уменьшает воспаление за счет приостановки производства PGE-2, COX-1 и COX-2 in vitro и экспрессии in vivo. Использование излучения 635 нм может значительно снизить продукцию IL-6 и IL-8 из hGF, обработанных LPS P. gingivalis. Однако, несмотря на данные, которые показывают влияние излучения 635 нм, исследований in vitro влияния излучения 810 нм (диодный лазер) и 1064 нм (Nd: YAG-лазер) на продукцию IL-6 и IL-8 из фибробласты десен, стимулированные LPS P. gingivalis. Единственные ограниченные данные об эффекте 810 нм касаются оценки in vivo LLLT-подавления продукции IL-6 иммуносупрессивными крысами.

Таким образом, целью настоящего исследования было изучить влияние 810 нм (диодный лазер) и 1064 нм (Nd: YAG-лазер) на продукцию IL-6 и IL-8 из фибробластов десен, зараженных ЛПС P. gingivalis.

Фрагменты раздела

Культура клеток

Первичные фибробласты десен человека культивировали в среде DMEM / F12 (без фенолового красного) с добавлением 5% фетальной бычьей сыворотки и 1% раствора пенициллина-стрептомицина в стандартных условиях, 37 ° C, 5% CO2. Все эксперименты были выполнены трижды в 3 независимых прогонах. Все среды и реагенты были приобретены у Sigma Aldrich, если не указано иное.

Вызов LPS и лазерное облучение

Десневые фибробласты человека высевали с плотностью 1 × 104 клеток / см2 в 12-луночный планшет и инкубировали.

МТТ анализ

Облучение лазером имело общий положительный эффект на жизнеспособность клеток с более высоким числом жизнеспособных клеток по сравнению с не стимулированным контролем LPS через 24 и 48 часов. Метаболическая активность фибробластов десен, облученных Nd: YAG, статистически значимо увеличилась по сравнению с необлученной группой через 24 ч после облучения (p < 0, 05), что позволяет предположить

Обсуждение результатов

Наше исследование показало, что облучение фибробластов как лазером Nd: YAG (1064 нм), так и диодным лазером (810 нм) положительно влияет на пролиферацию клеток через 24 часа. Этот эффект LLLT был подтвержден предыдущими исследованиями как для диодных, так и для Nd: YAG-лазеров.Однако этот пролиферативный эффект, по-видимому, снижается через 48 и 72 часа после облучения.

В заключение

Настоящее исследование показывает, что НИЛИ с использованием лазеров на диоде 810 нм или Nd: YAG 1064 нм оказывает положительное влияние на снижение продукции ИЛ-6, ИЛ-8 фибробластами, что демонстрирует его противовоспалительный эффект. Клинически НИЛИ с использованием диодного лазера 810 нм или лазера Nd: YAG 1064 нм может быть полезен для контроля воспаления как при лечении гингивита и пародонтита, так и во время поддерживающего лечения, в случаях, когда воспаление наблюдается в отдельных областях полости рта.